再也不用自己设计引物了
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但是设计出引物仍旧P不出来，可如何是好。尤其对于我们第一次设计引物的，还是比较恐怖自己设计的好不好，能不能用问题。
科学总是在不断发展，最近发表的两个数据库，对于我们设计引物小白来说，简直就是福利了，不用自己去摸条件设计引物了，直接查阅即可了。主要的参考文献如下：
Lu K, Li T, He J, et al. qPrimerDB: a thermodynamics-based gene-specific qPCR primer database for 147 organisms[J]. Nucleic Acids Research, 2017.
Sang J, Wang Z, Li M, et al. ICG: a wiki-driven knowledgebase of internal control genes for RT-qPCR normalization.[J]. Nucleic Acids Research, 2017.
实时定量PCR是一种能够对目标基因的表达量进行准确定量分析的试验技术。与传统的基因表达检测方法相比，该技术具有灵敏度高、特异性强、低样品需求量及检测范围广等特点。因此，实时定量PCR技术已经被广泛地应用于分子生物学的研究当中。然而，内参基因以及qPCR引物的特异性和扩增效率直接关系到实时定量PCR结果的准确性和精确性，因此筛选出合理的内参基因，设计出高质量的qPCR引物对实时定量PCR至关重要。近日，北京基因组研究所生命与健康大数据中心开发的国际上首个实时定量PCR内参基因知识库ICG，与西南大学农学与生物科技学院等单位研究构建的qPCR引物数据库qPrimerDB，相辅相成，相信大家以后再也不用为荧光定量而烦恼。下面就这两个数据库做一个简单的介绍。
ICG（http://icg.big.ac.cn/）
ICG是国际首个实时定量PCR内参基因知识库，其收录了包括动物（73）、植物（115）、真菌（12）和细菌（9）在内的209个物种的内参基因；ICG不仅为蛋白质编码基因的表达模式研究提供实时定量PCR技术的标准化分析方案，也关注于非编码RNA（如miRNA和circular RNA）的表达分析研究。ICG提供了两个主要的分类＂Species＂和＂Genes＂以允许用户访问内参基因以及相关的特定实验条件。
1.1 ＂Species＂
进入主界面，点击＂Species＂选择你所需要的物种。
以大豆为例，出现以下界面。主要包括对该物种的描述，实验条件，参考文献和分类四个部分。对于每一个实验条件，ICG都提供了丰富的信息以供参考。
1.1.1 ＂ Description＂部分是对物种的简单描述。
1.1.2 第二部分是不同实验条件下（不同组织及不同胁迫处理）内参基因的详细信息
1.1.2.1 ＂Internal ControlGenes＂，该部分以列表的形式列出了内参基因的基因符号，基因名字，所适用的实验条件，基因编号，引物序列，产物大小，退火温度以及做RT-qPCR时所使用的检测方法。
1.1.2.2 ＂Molecular Types＂，指内参基因的分子类型（mRNA，miRNA和circular RNA）
1.1.2.3 该部分提供了内参基因稳定性的评价方法以及相关的参考文献，此外还提供了通讯作者的相关信息和文章被引用情况。
1.1.3 ＂References＂，与该物种有关的参考文献。
1.1.4 ＂Categories＂，分类信息。
1.2 ＂Genes＂
考虑到一个基因可能被用作多个物种的参考基因，ICG设置了一个专门的页面(http://icg.big.ac.cn/index.php/ICG:Genes)，该页面包含了基因符号，基因全称，物种名字，实验条件以及参考文献等信息。我们可以在搜索框中输入我们想要查找的内参基因，以actin为例，在搜索框中输入actin进入下图界面，所有物种的actin基因就会显示出来。
点击基因符号中的ACT进入下图界面，该界面包括SynonymousGenes, Applicable Species, Featured Sequence, Conserved Domains和ExternalLinks五个部分。
1.2.1 ＂Synonymous Genes＂
该部分给出了所搜索内参基因的所有同义词，如ACT又叫Actin，Actin7, beta-actin等。
1.1.2 ＂Applicable Species＂
内参基因适用的物种，基因名字，推荐的适用条件，参考文献信息以及对应的超链接等。
1.2.3 ＂Featured Sequence＂
该部分提供了代表物种的ACT基因序列
1.2.4 ＂Conserved Domains＂
代表物种中ACT基因的保守结构域信息。
1.2.5 ＂External Links＂
与ACT基因相关的外部超链接。
1.3 ICG还提供了专门用于查找非编码RNA内参基因（http://icg.big.ac.cn/index.php/Category:Non-coding_RNA）以及用于下载内参基因基因序列（http://icg.big.ac.cn/index.php/Downloads）的界面，以方便用户的使用。
ICG知识库提供了丰富的实时定量PCR内参基因信息，以帮助小伙伴们针对各自的实验目的来定制出合理的标准化分析策略，筛选出合理的内参基因。
2. qPCR引物数据库－qPrimerDB
qPrimerDB（http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb）是西南大学农学与生物科技学院等单位研究构建的。该数据库共包括147个已经完成全基因组测序的物种，这147个物种包含80种动物（37种哺乳动物、17种昆虫、10种鱼类、4种鸟类和12种其他动物）、1种真菌（酵母）和66种植物（39种双子叶植物、18种单子叶植物和9种其他植物）。
2.1 Browse function
有两种方法可以浏览关于一个特定物种qPCR引物的所有信息。以模式作物拟南芥为例。第一种方法是在主页中直接点击Plants－Eudicotyledons－Arabidopsis thalians来浏览拟南芥的qPCR引物信息，第二种方法是通过导航栏中的＂Browse＂模块来选择你感兴趣的物种。
当我们选择好物种之后，就会出现关于拟南芥25995个基因最佳引物的详细信息。包括引物ID，基因ID，primer level，正向引物序列，反向引物序列，引物对的覆盖率，扩增产物的大小，GC含量，正向引物的退火温度，反向引物的退火温度，正向引物的自由能，反向引物的自由能和跨越的外显子数。可以通过更改页面右下角＂Show rows＂的数字来选择每页结果所显示的条数，点击每一列右上角的筛选按钮可以对结果进行筛选和排序。
点击图A PrimerID下的蓝色方框，就会显示出该引物的详细信息。除了上图中列表中给出的信息之外，还包括扩增产物的序列信息和相应基因的CDS序列信息，如图B。
点击图A中Gene ID下的蓝色方框或图B左上方的蓝色方框，就可以看到该基因的所有引物列表。
点击上图＂primerID＂下的蓝色方框，就进入了该引物的详细信息界面，包括引物的描述信息和引物的序列信息，如下图。
2.2 搜索功能
该网站还提供快速搜索功能，在该网站每一个页面的右上角都有一个搜索框，先点击＂Organisms＂按钮，选择一个或多个要搜索的物种，然后在搜索框中输入关键字进行搜索，用户可以选择三种类型的关键字：＂Gene Description＂，＂Gene IDs＂和＂Primer IDs＂。
下面以拟南芥RNA聚合酶为例进行搜索，点击＂Organisms＂按钮，选择＂Arabidopsisthaliana＂，在搜索框中输入＂RNA polymerase＂，然后点击＂Search＂按钮。
搜索结果如下，不仅可以点击蓝色方框看相应引物和基因的详细信息，还可以选择勾选列表左侧的方框，再点击底部的绿色方框，将结果输出为XLS或JSON格式的文件。是不是很方便呢？
2.3 qPrimerDB的BLAST功能
qPrimerDB BLAST是用NCBI-BLAST+构建的比对工具，用于在数据库中比对和搜索同源序列，可以同时选择多个数据库进行比对。由于同一个基因在不同的数据库中有不同的基因ID号，因此qPrimerDB提供了一个BLAST功能，用于将qPrimerDB无法识别的基因ID转化成可以识别的基因ID。
下图红色方框是Blast中的一些常用参数。＂Database＂用来选择所要搜索的数据库。＂Program＂可根据query序列的类型进行选择，blastn是指用核酸序列搜索核酸数据库；blastx是指用蛋白序列来搜索核酸数据库，核酸数据库中的序列按照六个读码框翻译后与蛋白质序列进行比对搜索；tblastx是核酸序列对核酸库在蛋白质质级别的比对，两者都在搜索之前翻译成为蛋白质进行比对。＂Expect＂是期望值。＂Word size＂用来设定字长大小，值越大，比对上的结果越少。输出格式有＂Strandard＂和＂Table＂两种形式。在空白文本框中输入FASTA格式的序列文件，或者基因ID（在ID号前必需加＂ID:＂前缀），点击＂Submit＂进行搜索。
若结果选择标准输出，则点击＂Get Primer＂按钮来获得引物的详细信息；若结果是列表输出，则点击蓝色方框的超链接进入引物详细信息界面。
2.4 下载
在qPrimerDB中，每个物种的最佳引物和所有的qPCR引物被分别压缩成了两个zip文件以供下载。用户可以通过导航栏的＂Downloads＂菜单进行下载。在下载的文件中除了浏览和搜索工具中展示的结果外，还包括正向和反向引物的ID。
2.5 用户手册
在主页＂Documents＂菜单下的＂Manual＂有用户使用手册，使用户能轻松了解数据库的特点以及高效地获取qPCR的引物和相关信息。
有了qPrimerDB数据库，我们再也不用自己设计qPCR引物了！
一个物种一个家