原花青素对反复力竭后大鼠骨骼肌凋亡蛋白的影响

　　【摘 要】观察原花青素对反复力竭运动后大鼠腓肠肌自由基代谢和细胞凋亡相关蛋白TNF-a、Fas、caspase-8表达的影响。方法：建立大鼠反复力竭动物模型及原花青素药物模型，雄性SD大鼠40只，随机分为4组，即安静组（C）、给药组（M）、力竭组（E）、给药+力竭组（ME），E组、ME组均进行四周的反复力竭跑台训练。检测力竭运动后各组大鼠骨骼肌线粒体丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）氧自由基损伤相关指标的变化，TUNEL法检测腓肠肌凋亡，免疫组化技术检测腓肠肌组织中TNF-a、Fas、caspase-8蛋白水平差异表达；Real-time PCR技术检测TNF-a、Fas、caspase-8mRNA表达水平。
　　【关键词】原花青素；大鼠；力竭运动；骨骼肌；凋亡蛋白
　　运动疲劳导致骨骼肌损伤是运动训练中常见的运动性疾病，其发生机制主要是训练时肌肉负荷过大，超过机体的承受能力，长期运动训练后肌肉生理机能未能得到充分恢复，导致运动与恢复动态平衡的失衡。研究運动疲劳致肌肉损伤的病理机制及防治措施，对我们预防运动训练损伤、提高训练及比赛成绩以及在运动健身和功能恢复等领域，具有十分重要的意义。
　　本文通过研究运动过程中骨骼肌生化、酶学及相关蛋白基因表达等方面的变化，探讨骨骼肌细胞凋亡及坏死发生的可能机制进行初步探讨，并揭示原花青素对反复力竭运动后对大鼠骨骼肌的保护机制，为今后其在运动领域上的应用提供更一定的理论支持。以期为运动损伤的预防及治疗的措施提供理论依据。
　　一、研究对象与方法
　　（一）研究对象
　　健康SD大鼠40只，雄性，体重210g-250g，室温控制在20-25℃，自由饮食，每笼10只，适应性喂养3天。
　　（二）研究方法
　　1.分组
　　将大鼠随机分成4组，即安静组（C）、给药组（M）、力竭组（E）、给药+力竭组（ME），每组10只。
　　2.给药方案纯度为95%的原花青素（购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司），配制成10mg/mL的原花青素水溶液，以15mL/（kg·d）对M组和ME组大鼠灌胃给药，C组和E组按其体重灌胃15mL/（kg·d）生理盐水。每日晨起称重，根据体重变化，计算给药量。
　　3.运动方案
　　参考Bedford（1979）所建立的渐增负荷运动模型（下坡跑），第一级负荷：00，8.2m/min，15min（相当于53%V02max）；第二级负荷：50，15m/min，15min（相当于64%VO2max）；第三级负荷：100，19.3m/min （相当于76%VO2max），持续运动至大鼠力竭。E组和ME组大鼠，每周运动6天，休息一天，连续运动6周。运动中使用光、电、声刺激维持运动强度。力竭标准：大鼠跑姿由蹬地式变为伏地式，滞留在跑道端不能继续跑动，给予声波和光刺激均不能驱使大鼠继续维持跑动。
　　4.取材
　　末次运动24h后，用10%的水合氯醛麻醉（0.3ml/100 g 体重），使用灭菌镊子以摘眼球的方式取血，收集血液于10 ml 离心管中， 4℃、6000r/min 离心 10 min，小心吸取上层血清500 μl，用离心管分装并冷冻保存于-20℃。取出腓肠肌组织，部分腓肠肌组织用4%多聚甲醛溶液固定，放入4℃冰箱存储备用，剩余部分肌肉组织保存于超低温冰箱（-80℃）中备用。
　　5.细胞凋亡的检测
　　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法 （terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling，TUNEL ）进行细胞凋亡检测，TUNEL试剂盒购自于美国Promega公司。在普通光学显微镜下观察，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染。光学显微镜（×400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少 100 个细胞核水平。以 Simple PCI 显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（Apoptosis Index ，AI）。
　　6.腓肠肌组织SOD检测
　　7.腓肠肌组织MDA检测
　　8.腓肠肌组织蛋白印迹检测
　　腓肠肌TNF-a、Fas、caspase-8蛋白测定：采用Western免疫印迹检测。各细胞因子蛋白测试时分别取腓肠肌100mg加入组织裂解液匀浆，后离心（16000/min，30min）取上清，标定蛋白浓度上样后，经12%的SDS-PAGE电泳分离。将目的蛋白转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭，TBST冲洗后加一抗4℃过夜。TBST液冲洗，加碱性磷酸酶标记的二抗1：3000稀释液孵育，NBT/BCIP显色，以各细胞因子与Beta-Actin的比值作为相对表达量。
　　9.R-T PCR检测
　　（1）总RNA提取以及反转录
　　总mRNA提取：采用动物组织RNAprep Pure Tissue Kit试剂盒，购自于天根生化科技（北京）有限公司；酸浓度测定仪（Eppendorf 德国）测定提取的总RNA浓度及吸光度值（A），均测得A值 1.9 < A260/A280 < 2.0 再行下一步实验 ；琼脂糖凝胶电泳显示 28 S、18 S、5 S 三条电泳条带，表明所提取的总RNA无降解，可作为逆转录反应的模板。
　　mRNA的逆转录：准备20ul的反应体系，42℃反应60min。70℃热处理5min，加水稀释至100ul，-20℃保存或者做后续实验。
　　（2）Real-time PCR
　　仪器：ABI 7900HT，（ABI公司）试剂：SYBR R Premix Ex Taq TM（Takara）试剂盒。根据Gene Bank核酸数据库中血管各因子cDNA序列，Fas、caspase-8基因引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，引物均购于上海生工公司。引物合成序列如下：
　　TNF-a-A： 5- CAT GGA TCTCAAAGACAACAAA-3；TNF-a-B： 5-CTCCTGGTATGAAATGGCAAAT-3；
　　Fas-A： 5-AGCTCCTTTGGCTGCTGATCCTC-3；Fas-B： 5-CGTGAGATTGATACCAGCACTG-3；
　　Caspase-8-A，5-TGCCCTCAAGTTCCTGTGCTT-3；Caspase-8-B，5-TTCCTCCAACATCCCCTCTTC-3；
　　GAPDH-A：5-ATGACCACAGTCCATGCCATCAC-3；GAPDH-B：5-CACCTTCTTGATGTCATCATACTTG-3
　　（三）统计学分析
　　采用中文SPSS19.0 软件进行统计学分析，并采用SigmaPlot10.0软件作图，数据统计以平均数±标准差（±s）来表示，组间对比分析采用单因素方差分析方法，采用双侧t检验进行两两比较，若P﹤0.05表示为具有显著统计学意义，若P﹤0.01表示为具有非常显著统计学意义。
　　二、结果
　　（一）各组大鼠腓肠肌细胞凋亡率
　　表1显示：各组大鼠腓肠肌细胞凋亡率分别为：C组为1.54%、M组为1.35%、E组15.73%、ME组为3.26%。C组和M组相比没有显著性差异（P﹥0.05），但E组、ME组细胞凋亡率与C组有非常显著性差异（P﹤0.01）。与M组相比，E组、ME组细胞凋亡率有非常显著性差异（P﹤0.01）。与E组的抑制率相比，ME组细胞凋亡率有非常显著性差异（P﹤0.01）。
　　（二）各组大鼠腓肠肌细胞内SOD、MDA活性
　　表2显示：大鼠腓肠肌细胞内SOD活性，C组与M组以及ME组相比有显著性差异（P﹤0.05），C组与E组相比有非常显著性差异 （P﹤0.01）。与M组相比，E组、ME组细胞SOD活性有非常显著性差异（P﹤0.01）。与E组腓肠肌SOD活性相比，ME组有非常显著性差异（P﹤0.01）。大鼠腓肠肌细胞内MDA活性，C组与M组相比没有有显著性差异（P﹥0.05），C组与E组相比有非常显著性差异 （P﹤0.01），C组与ME组相比有显著性差异 （P﹤0.05）。与M组相比，E组组腓肠肌细胞MDA活性有非常显著性差异（P﹤0.01），ME组组MDA活性有显著性差异（P﹤0.05）。与E组腓肠肌MDA活性相比，ME组细胞有非常显著性差异（P﹤0.01）。
　　（三）各组大鼠腓肠肌组织TNF-a、Fas、caspase-8m RNA表达检测结果
　　Real-time PCR结果显示：TNF-a、Fas、caspase-8 mRNA的表达：与C组相比，E组存在显著性差异（P<0.01），M组、ME组不具有差异性（P﹥0.05）；与M组相比，E组存在显著性差异（P<0.01），ME组不具有差异性（P﹥0.05）；与E组相比，ME组存在显著性差异（P<0.01）。
　　（四）各组大鼠腓肠肌组织TNF-a、Fas、caspase-8蛋白检测结果
　　由表3和图1可以看出，E组TNF-a、Fas、caspase-8蛋白明显高于其他各组（P<0.01），C组和M组相比没有显著性差异（P﹥0.05）。TNF-a蛋白表达与M组相比，ME组有显著性差异（P﹤0.05）。Fas蛋白表達与C组相比，ME组有显著性差异（P﹤0.05）。
　　三、讨论
　　（一）骨骼肌细胞凋亡的检测
　　Podhorska-Okolow等的研究发现，未经运动的小鼠在进行一夜轮形笼自发跑步后，凋亡肌细胞明显高于对照组，在4d后减少。Boffi等以纯种马为研究对象，对其进行3个月跑台训练，跑台运动结束后采用原位末端标记法（TUNEL）和DNA琼脂糖凝胶电泳的研究后发现，运动训练组的肌细胞凋亡数量明显增多，推测训练导致体能增长的原因在于新生细胞不断代替凋亡的异常肌细胞。王长青等以大鼠为研究对象，对大鼠进行了为期1d，6d，12d和18d的运动训练，运动训练结束后40min取材，用流式细胞技术和TUNEL法检测骨骼肌细胞的凋亡情况，研究发现运动训练可使骨骼肌细胞凋亡的比例增加，骨骼肌细胞凋亡的比例增加明显高于对照组，其中以训练6d组骨骼肌细胞凋亡的比例最高。罗吉伟，透射电镜观察SD大鼠研究发现，经过4周反复力竭运动后大鼠骨骼肌肌丝排列紊乱等坏死表现，核固缩等凋亡表现，线粒体肿胀和空泡变性等异常表现，且流式细胞仪检查发现各运动组大鼠腓肠肌细胞凋亡和坏死增多。宋卫红等人经过实验发现SD大鼠在跑台，经过3d重复性力竭运动后，骨骼肌细胞核发生了凋亡，其凋亡指数在运动后即刻明显升高，运动后24h达到峰值。
　　本实验结果表明，SD大鼠经过6周反复力竭运动后，骨腓肠肌细胞发生了凋亡，与安静组（C）组相比，有显著的差异。ME组细胞凋亡率高于C组和M组，但与E组相比，已经有明显降低。这表明，原花青素对反复力竭运动过程中大鼠腓肠肌细胞凋亡具有明显的抑制作用。
　　（二）原花青素对反复力竭运动后大鼠腓肠肌自由基代谢的调节作用
　　研究表明反复力竭运动后，体内会产生大量的活性氧自由基，而它的大量堆积会介导和损伤正常的组织细胞，如细胞膜脂质过氧化、Ca离子超载等。自由基特点：活泼性高和氧化性极强，能通过氧化作用攻击体内的生物大分子物质，使脂质、蛋白质、核酸、糖类等发生过氧化变性、交联和断裂，从而破坏细胞结构和功能。生物膜是由各种蛋白质和脂类构成，生物膜上存在各种不饱和脂肪酸，这就很容易使得生物膜成为自由基的攻击对象，并伴随有分解产物丙二醛（MDA）的产生。
　　实验结果看出，大鼠反复力竭运动，E组和ME组腓肠肌丙二醛（MDA）含量都显著增高，此结果与之前的研究报道相一致，说明反复力竭运动后活性氧的大量产生会导致细胞膜的脂质过氧化损伤，虽说ME组（MDA）含量水平增高，但是与E组相比，ME组升高水平低了很多。实验发现大鼠反复力竭运动过后腓肠肌超氧化物歧化酶（SOD）活性成下降趋势，与安静组相比具有显著性差异。虽然ME组腓肠肌SOD含量显著降低，但ME组腓肠肌SOD的活性显著高于E组。这说明反复力竭运动会导致活性氧过量的产生和堆积从而限制了抗氧化酶的活性，还可以说明原花青素一定程度上具有提高SOD活性的能力，进而抑制MDA活性，从而达到抗肌纤维活性氧损伤和维持细胞完整性的作用。
　　（三）原花青素对反复力竭运动后大鼠腓肠肌TNF-a、Fas、
　　caspase-8因子的影响
　　TNF-a、Fas蛋白、及死亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）属于凋亡调控因子。肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员的跨膜蛋白受体，通过与相关配体结合发生寡聚化及结构的改变，暴露出能与衔接蛋白结合的DD，聚集并激活衔接蛋白，引发下游caspase-8的活化。Fas，即CD95分子，属于Ⅰ型膜蛋白。Fas主要以膜受体形式存在，在细胞凋亡中具有信号转导作用。FasL属于细胞表面的一种Ⅱ型膜蛋白。FasL可与Fas结合，最终会引起胞质内前半胱胺酸天冬酶8（Procaspase-8）分子激活，而后激活的caspase-8进一步自我激活启动下游的Caspase相关蛋白酶级联反应，最终导致细胞凋亡。另一方面激活的Caspase-8也可将位于胞浆的Bid切割成截断的Bid（tBid），tBid有很强的促凋亡活性，再次作用于线粒体释放Cytc，通过Caspase-9/3发挥促凋亡作用。研究发现，一次性大负荷运动后会引起大鼠腓肠肌细胞TNF-α、FAS蛋白表达显著升高。邬卓文，研究发现大鼠经过22d力竭游泳运动后会导致血清TNF-α的升高。姜振等研究发现，大鼠经过急性力竭运动后，Fas的mRNA水平明显增高。陈筱春研究发现，经过6周跑台后大鼠Caspase-8水平明显升高。大负荷、一次性力竭或是反复力竭运动后TNF-a、Fas、caspase-8因子的表达水平异常升高，这与本研究结果一致。
　　本实验发现，通过大鼠腓肠肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表达面积和mRNA的水平比较，发现E组合ME组大鼠腓肠肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表达和mRNA的水平都明显高于安静组和M组。C组TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平，虽然高于M组但组间不具有差异性。E组TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表达和mRNA的水平，显著高于ME组。结果表明，长期反复的力竭运动使得TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA在大鼠腓肠肌内过量表达，同时ME组的TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA较M组低得多，可以推测原花青素对长期反复力竭运动导致的大鼠腓肠肌内TNF-a、Fas、caspase-8因子具有抑制性作用。
　　【参考文献】
　　[1] 王华，刘霞，杨继红，李华.葡萄籽原花青素抗癌活性及其机制研究进展. 安徽大学学报2012（36）： 101-108.
　　[2] Xu Z，Du P，Meiser P，Jacob C.Proanthocyanidins： oligomeric structures with unique biochemical properties and great therapeutic promise[J]. Nat Prod Commun 2012，7： 381-388.
　　[3] Bagchi D， Swaroop A， Preuss HG， Bagchi M. Free radical scavenging， antioxidant and cancer chemoprevention by grape seed proanthocyanidin： an overview[J]. Mutat Res 2014； 768： 69–73.
　　[4] 赵平， 张月萍， 刘俊英， 等. 原花青素分级分离[J].中国食品添加剂， 2011（ 6） ： 75-80.
　　[5] LELONO R A，TACHIBANA S. Bioassay-guided isolation and identification of antioxidative compounds from the bark of Eugenia polyantha[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2013， 16（16）： 812-818.
　　[6] 高羽，董志.原花青素的药理学研究现状[J]. 中国中药杂志. 2009，34（6）： 651-655.
　　[7] FRACASSETTI D，COSTA C，MOULAY L，et al. Ellagic acid derivatives，ellagitannins，proanthocyanidins and other phenolics，vitamin C and antioxidant capacity of two powder products from camu-camu fruit （Myrciaria dubia）[J]. Food Chemistry， 2013， 139（1-4）：578-588.
　　[8] 剧红梅，曲梓怡，孙冬阳等.原花青素对大鼠力竭运动后不同时相肝脏自由基代谢的影响[J]. 成都体育学院学报， 2008， 34（10）：74-78.