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三大基因编辑技术简介及其在畜牧育种中的研究进展


  【摘 要】随着社会的进步和人们对美好社会需求的不断提高,基因编辑技术迅速发展,被广泛应用于生命科学领域。本文对基因编辑的三大技术方法进行简要介绍,同时对其在畜牧育种中的研究进行综述,并对未来基因编辑技术进行展望,以期为进一步研究基因编辑技术提供理论依据。
  【关键词】基因编辑技术;畜牧育种
  基因编辑(Gene Editing)技术是指一种对目的基因或转录产物进行插入、敲除和定点突变等定点精确修饰的生物技术。该技术主要利用人工核酸酶实现对基因组上特定DNA片段的敲除、敲入或修饰。目前主要有三大基因编辑技术,锌指核酸酶(ZFNs)技术,类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术和CRISPR/Cas9技术。近年来,这三大技术在畜牧育种中应用广泛,在动物性状改良方面起到了巨大作用。
  一、锌指核酸酶(ZFNs)技术
  锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)是第一代人工核酸内切酶,由锌指蛋白(zinc finger proteins, ZFPs)的DNA识别结构与非特异性 FokI 核酸内切酶融合而成。ZFPs组成的 DNA 识别域包含至少三个Cys2His2锌指蛋白可与目的基因位点结合,而FokI 是一种核酸内切酶发挥"剪刀"的功能,对目的基因进行剪切,由此达到基因编辑的。ZFPs 作为一类特殊的转录调控因子,在生物体的细胞分化、胚胎发育以及基因表达调控等多个方面发挥重要作用。
  在动物活体细胞中,Bibikova等首次利用ZFN技术在非洲爪蟾卵母细胞中实现了基因打靶,从此, ZFNs技术开始被广泛应用于多种哺乳动物的基因编辑中。2011年,Hauschild 等将 ZFNs基因组编辑技术应用于猪,利用基因打靶获得了α-1,3-半乳糖基因敲除猪,为器官移植技术提供了新的思路。Whyte等将体细胞核移植技术与ZFNs技术相结合,从而获得转基因猪。2013年,Marron等利用ZFN技术成功在猪上敲除了MSTN基因,使得猪肌肉生长抑制素的形成被破坏,从而使得猪的瘦肉率得到显著提高。Cui等在2015年利用ZFNs技术在猪上得到新的突破,获得了具有生长激素受体的转基因猪, 使得研究人类疾病有了理想的新动物模型。ZFNs技术研究在牛上研究同样广泛,2011年Yu 等利用ZFNs 技术,获得了具有更高牛奶营养品质的转基因牛,他们敲除了β-乳球蛋白基因,该基因在牛奶中具有致敏性。
  ZFNs技术由于发现时间较早,研究广泛,试验技术虽相对完善,但脱靶现象严重,细胞毒性大等缺点使其进一步推广应用受到严重制约。
  二、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术
  转录激活因子效应物(transcription activator-like effector, TALE)和 FokI 连接构成了TALEN 结构。在ZFNs技术之后,TALEN是第二个被广泛认可的基因编辑技术。TALEN技术在应用时,首先要设计TALE的识别单元,TALE的DNA识别域由多个重复氨基酸模块组成,这些氨基酸序列十分保守。紧接着将识别单元与FokI相结合,构建TALEN质粒。TALEN技术的剪切机制是依靠TALE 特异性结合到靶位点上,其切割域形成特异性的二聚体,可使识别位点间的目标基因核苷酸实现断裂,从而完成目的基因编辑。目前构建TALEN 的方法主要有:TALEs"黄金大门"克隆法;迭代帽组装法;固相高通量自动连接技术;非连接酶依赖型克隆法等。
  TALEN基因编辑技术被广泛应用于多种饲养动物中,2012年Carlson 等利用TALEN 技术敲除了猪细胞中多个基因,为 TALEN 技术在转基因猪上的广泛应用提供了研究思路。2013年, Xin等又利用该技术将猪的GGTA1基因成功进行定点敲除。2014年,Li等在猪上发现了ROSA26 基因位点,并成功利用 TALEN 技术进行定点敲入。2015年,Wu等利用 TALE技术成功在牛的常染色体中敲入小鼠的 SP110 基因,从而得到了23 头可抵抗牛结核分枝杆菌的转基因牛。同年在转基因羊的研究上,Cui 等利用TALEN技术将人乳铁蛋白敲入羊的常染色体使其替代了羊自身的β乳球蛋白,从而使得羊奶的营养价值得到了显著提高。
  TALEN技术相较于ZFNs技术,其优势在于可以定点识别目标基因,从而使得基因剪切编辑更加准确高效,同时与ZFNs技术相比它的脱靶效应以及细胞毒性都得到了有效改善。
  三、CRISPR/Cas9技术
  CRISPR/Cas9技术是一种由RNA介导的基因编辑技术,该项技术的兴起引发了基因编辑领域新的革命。CRISPR是从对真菌和古菌宿主的研究中衍生而来的,1987年日本的Ishino等,在大肠杆菌的DNA中发现有串联间隔重复序列的特殊结构交替出现。一直到2012年,这种重复序列才被命名为规律性聚簇间隔短回文重复即CRISPR。CRISPR系统可分为三大类型: I型、II型和III型,CRISPR/Cas9便属于II型,II型系统相较于其他类型,结构较简单, 只需要一个Cas9蛋白来识别目的基因序列。现在最简便且应用最广泛的CRISPR/Cas9 技术是将利用sgRNA引导Cas9 蛋白识别特定基因序列的PAM区,造成双链 DNA 断裂,并启动 DNA 损伤修复机制。
  目前CRISPR/Cas9技术在畜牧生产中被广泛应用。2014年,Hai等利用CRISPR/Cas9技术编辑猪的vWF基因,从而为治疗血管性血友病提供了新的研究模型。2015年,水牛 BMP15 和 GDF9 基因被CRISPR/Cas9 技术进行编辑,从而加快了水牛繁殖性能的提高。2016年, Han等使用CRISPR/Cas9技术敲除了猪的Hoxc13基因, 从而为人类治疗外胚层发育不良提供了模型。2016年,在我国新疆,利用CRISPR/Cas9技术成功培育出具有不同毛色的转基因绵羊。2017年,Gao 等首次将NRAMP1基因利用CRISPR/Cas9技术敲入奶牛的基因组中,成功获得了转基因奶牛共11头,经研究发现,11头奶牛均未发生脱靶效应,说明CRISPR/Cas9技术可使基因编辑脱靶效应降低,从而为进一步研究轉基因家畜提供理论基础。此外,CRISPR/Cas9技术在小鼠细胞、恒河猴、食蟹猴、小鼠和人上均有相关研究报道。
  CRISPR/Cas9技術与TALEN技术和ZFNs技术相比, 其切割效率相对较高且操作简单。同时,能够更为精确且高效的对目标基因进行定点编辑,并且同时进行多位点的编辑。CRISPR/Cas9 技术目前还具有一定的局限性,其受到 PAM 元件的制约,不能完全识别特异性的DNA序列。
  四、展望
  基因编辑技术被认为是一种理想的基因操作手段,至今已达到一定的高度,具有效率高、定向编辑准确性高、适应性广等优点。随着科学的快速发展,基因编辑技术必将不断完善,通过敲除和敲入等手段获得家畜优良的生产性状,加快我国畜牧业发展的速度,从而为改善国民生活做出贡献,此外也可利用基因编辑技术,建立动物研究模型,使其在生命科学和医学方面更好的为人类服务。此外,基因编辑技术还存在脱靶率高、特异性以及效率低等问题,更加有效的利用基因编辑技术还有待进一步研究。随着科学的发展,各种各样的基因编辑工具不断更新,使得人们对基因编辑的研究也更加深入,不过想要真正将其应用于畜牧育种中,还需科技工作者继续努力。
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