病原微生物检测技术研究进展

　　徐梦娇 高姗姗 肖尧
　　【摘 要】对于病原微生物的检测技术主要有常规检测、免疫学检测以及基因检测等，但由于各种检测方法均有其优缺点、检测范围以及使用领域，因此，为适应现代社会对检测病原微生物的要求，必须加强对病原微生物检测技术的研究、创新，在实际工作中，依据检测设备技术条件，综合考量各自检测方法，以选取检测效果较好的方法。文章主要对各种病原微生物检测技术进行分析。
　　【关键词】病原微生物；检测技术；研究进展
　　病原微生物主要指对人和动物存在致病性的各类微生物，包括细菌、病毒、真菌、放线菌、螺旋体、朊粒、立克次体、支原体、衣原体等。病原微生物会影响食品以及水源的安全，人和动物感染病原微生物以后，会出现过敏反应或者痴呆、肿瘤等多种疾病。随着现代检验技术的不斷发展，病原微生物检测技术也得到了发展，从常规检测发展到免疫学检测技术、基因检测技术等，并广泛用于医疗、疾控、食品安全检验等方面。
　　一、病原微生物常规检测方法
　　（一）涂片镜检法
　　在染色和形态上具有明显特征的病原微生物适合使用涂片镜检法进行检测。例如，白喉棒状杆菌、葡萄球菌或结核分枝杆菌等引起感染性疾病的病原微生物，经过适当处理，将标本置于显微镜下检测，分别呈现有异染颗粒的棒状杆菌、革兰阳性葡萄串状球菌以及抗酸性细长杆菌等；对于粪便中的霍乱弧菌和志贺菌等，也可通过涂片镜检法，在荧光显微镜下进行快速检测。应用涂片镜检法进行病原微生物检测时，只需要革兰染色液和普通光学显微镜，是各类微生物检测实验室的常用检测方法。
　　（二）组织细胞培养检测法及生物化学试验
　　组织细胞培养检测法适用于组织细胞内生存的病原体，例如病毒、立克次体以及衣原体等。由于不同的病原体其组织敏感细胞也有差异，因此，可以从病原体敏感的动物组织中，提取活细胞于体外实施原代培养，或者实施传代培养，并将病原体接种到相应的组织细胞内，使病原体在细胞中进行繁殖增长，从而使特异性的细胞产生病变反应；还可以通过直接在敏感动物体内接种病原体，使相应的组织器官出现特异性的病理变化，从而根据出现的特异性病变鉴定病原体。一般情况下，多数病原体在培养16～20小时后均可以得到理想的菌落，但也有少量病原菌需要经过数月的培养，才能形成一定数量的菌落，但在实际工作时，检测人员往往需要快速、准确的知晓病原微生物种类，随着各种全自动微生物及药敏系统的研发以及广泛应用，能够有效缓解这一情况。
　　二、免疫学检测方法
　　（一）免疫荧光技术
　　免疫荧光技术（Immunofluorescence techⅡique），也就是通常所说的荧光抗体技术，主要内容是在该抗原或抗体上加入含有荧光的物质，需要保证该荧光物质不会影响机体的特性，通过显微镜进行观察，找到有荧光标记的抗原或抗体，从而实现监督和鉴别的功能。具体方法是：第一，抗体或者抗原从待检样本中分离出来，使抗体或抗原与固相载体发生反应；第二，将抗原或者抗体以洗涤的方式从固相载体中分离出来，让固相载体以一定的比例跟待检样本混合，并添加一些酶与其发生反应，从而产生易于辨别的有色物质，根据有色物质的深浅，就能够分析和判定待测样本中的微生物种类及状况等。该检测方式的优点是耗费时间较短、灵敏度较高。
　　（二）酶联免疫法
　　酶联免疫法应用范围较广，是一种固相免疫测定技术。该检测方法的内容是：在固原载体的表面吸附已知抗原或者抗体，保证其原本的免疫活性；在检测过程中，使待检测样本与表面吸附抗体或抗原的固相载体发生反应，然后加入酶标抗体，进行免疫复合物结合操作，采用洗涤方法，将抗原或者抗体复合物与游离的未结合成分进行分离；最后再加入酶反应底物，通过观察被酶催化后的底物所产生的颜色以及吸光度值大小，从而测定病原微生物种类。该检测方法具有方便快捷、特异性强、灵敏度高、易于标准化管理的优点，被广泛应用于多细菌检测工作中。
　　三、基因检测方法
　　（一）聚合酶链反应技术
　　聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是新型的基因检测方法。该技术主要是根据目的基因，设计一对特异寡核苷酸引物，在反应体系中加入4种dNTP和DNA聚合酶，以目的基因作为模板，进行DNA体外扩增的技术，由于反应可以进行多次循环，因此可以在短时间内扩增，以获得大量目的基因。PCR及其衍生的多种方法已广泛用于病原微生物的检测。例如病原性大肠杆菌O157：H7的检测，可使用实时荧光定量PCR或者随机扩增多态性（RAPD）DNA标记等方法。张洪军等利用PCR-DGGE与荧光原位杂交技术（FISH）技术，分析了生活污水中的硝化菌群；Yolanda等采用PCR和FISH，快速检测出弯曲杆菌。
　　PCR检测方法应范围很广，但由于DNA检测无法区分死、活细胞，从而无法准确判断微生物是否具有感染力。另外，PCR检测法反应灵敏，任何污染都会造成假阳性结果，任何抑制剂都会抑制PCR反应，因此，其稳定性较差，容易产生非特异性产物。
　　（二）DNA芯片检测技术
　　DNA芯片，也称为DNA微阵列，DNA芯片检测技术可在同一时间对大量样品进行高通量分析，芯片的类型可分为固定寡核苷酸探针和PCR扩展子两类。其主要内容是利用机械系统，将DNA探针阵列分布于硅基片或玻璃上，从而形成100～200μm的多个点，保证点间间距为200～500μm，每个点含单链的寡核苷酸片段，与待测组分进行杂交，通过检测荧光或其他标记物，进而检测病原微生物。检测流程如图1所示。
　　DNA芯片检测法使用特异DNA，检测速度快，可同时检测多种不同的病原微生物，可避免传统方法漫长等待影响检测结果，但DNA芯片法不适用于DNA浓度低时，PCR将会增加样本中DNA浓度，通过DNA芯片检测与PCR扩增结合，可以提高检测的灵敏度，更易于检测。相对于传统的培养方法，此方法更加快捷，可以对多种微生物同时进行检测，极大的加快检测速度，尽快得到检测结果。
　　四、结束语
　　随着我国社会的不断发展，各种病原微生物造成的问题层出不穷，这就对病原微生物检测技术提出了更高的要求。当前的病原微生物检测技术主要有常规检测技术，免疫学检测技术以及基因检测技术等，在操作简便，检测时不需要较多样本，节省时间，且不会出现污染，能够保证检测结果的准确性，但不论哪种检测方法都有其局限性，因此，在实际工作中，要根据病原微生物的特点，结合使用不同的检测方法，从而在病原微生物的检测方面发挥更加重要的作用。
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