lncrna引物设计（CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？） 经常会有小伙伴问用CRISPR/Cas9系统敲除整个外显子或者lncRNA的效率是多少，和敲除片段的大小有关系吗？为了回答这个问题，在此和大家分享一篇验证这类敲除效率的文章。 文章题为＂Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Nuclease System in Mammalian Cells＂，2014年发表在JBC上，NCBI显示目前已经累计被引用154次。 为了研究CRISPR/Cas9介导的基因组片段敲除的效率，该文章设计了一系列的成对sgRNA用于敲除长度在1.3kb到1MB的基因组上的片段（图1）。这些片段有些位于外显子区，有些位于内含子区，也有部分位于基因间区。且涉及被编辑的基因都与细胞增殖无关。 图1. 成对sgRNA靶点设计 成对sgRNA设计，虽然有可能会将两个sgRNA中间片段敲除，但也可能在原位修复，不发生删除。为了检测出现的具体结果，在不同的靶点附近，作者设计了多对引物。 图2. 修复结果分析的引物设计 在开始检测该细胞是否有等位基因发生敲除时，利用了图2中上面的蓝色及红色两对引物，红色引物位于两个sgRNA之间，蓝色引物位于两个sgRNA之外。此时有三种情况，第一，如果红色引物PCR后跑DNA胶无条带，蓝色引物PCR有条带（如果中间片段没有被敲除，蓝色引物中间片段过长，PCR无法扩增出该产物），则说明是纯合子敲除。第二，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR也有条带，则说明杂合子敲除。第三，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR无条带，则说明没有发生敲除。 但是，对于红色引物PCR产物有条带，还有一种情况需要分析，即两个sgRNA中间片段是否发生了颠倒。于是作者又设计了图2中下面的绿色及紫色两对引物用于扩增sgRNA靶点及其附近序列，如果引物1,2和引物3,4分别PCR有条带则说明没有发生颠倒，如果引物1,3和引物2,4有条带则说明中间片段发生了颠倒。 图3. 成对sgRNA切除基因片段效率 17对sgRNA挑选出了1974个克隆，最终共检测了278个单克隆细胞株。按照等位基因进行分析，278株细胞有556个等位基因。149/556(26.8%)个等位基因中间片段被删除，72/556(12.9%)个等位基因中间片段发生了颠倒，剩余约60%在Cas9切割的位置原位修复，未导致删除。在做外显子敲除时，等位基因颠倒的情况也是可以考虑的一种基因编辑方式。从整体看，等位基因颠倒加上删除的比例接近40%。但是，对于lncRNA的敲除，由于不确定颠倒是否会失活其功能，因此lncRNA不建议使用颠倒的克隆用于后续实验。 按照细胞株进行分析，31/278(11.2%)的细胞为双等位基因删除细胞，2/278(0.7%)的细胞为双等位基因颠倒细胞。26/278(9.4%)的细胞其中一个等位基因删除，一个等位基因颠倒。61/278(21.9%)的细胞其中一个等位基因敲除，另外一个等位基因在Cas9切割的位置原位修复。39/278(14.1%)的细胞其中一个等位基因颠倒，另外一个等位基因在Cas9切割的位置原位修复，而两个等位基因既没有删除又没有颠倒的细胞比例为119/278(42.8%)（图3）。 在将所有数据统合后，文章进一步分析了敲除片段长度与敲除效率的关系（按照等位基因进行分析），得出结论，敲除效率与敲除长度呈负相关性（图4）。可以看到，当敲除片段在23kb以内时，敲除效率基本都在10%以上，甚至还有许多片段的敲除效率在20%乃至30%以上。 除去这些敲除效率的信息外，文章中还有一些值得留意的细节。第一，6/40(15%)双等位基因敲除细胞是精确删除的；27/87(31%)的单等位基因敲除细胞是精确敲除的。补充一下，目前认为野生spCas9的切割位点位于靶点的第17和18位中间，切割产生平末端，所谓精确敲除即两个cas9切割后的序列直接相连，中间没有缺失或者插入其他序列。第二，对于不是精确删除的细胞，由于两个平末端是被NHEJ修复方式修复的，往往会引入一些indel，这些indel的长度绝大部分集中在-10bp-0bp（负号代表删除，正号代表插入）。第三，对于双等位基因敲除细胞，其中部分进行一代测序发现，22/31(71%)的细胞两个等位基因中间的indel序列是完全相同的，9/31(29%)的细胞两个等位基因的indel片段不同。 如果将这里的第一点和第三点结合起来看，会发现NHEJ比较有趣的一些内容。比如，如此高的精确修复比例，说明NHEJ修复过程中有很大可能是不引入indel的。再比如，高比例的纯合子删除（indel相同）暗示NHEJ可能存在按照模板修复的可能性。 注：低阳性比例细胞筛选方法优化 对于删除超过1MB（1000kb）的片段，即在染色体层面删除基因组的大片段，这篇文章筛选的比例为4/339，略微超过1%。还有其他一些文章筛选后给出的比例基本都是1%。如此低的比例如果去筛选单克隆细胞株的话，是一个非常大的工作。并且，1%并不意味着100个细胞一定能筛到一个，被各种游戏厂商骗去抽过卡的同学可能更能理解什么叫非酋。因此，这里给大家介绍一个方法，可以在有限稀释的时候按照每孔5-10个细胞进行稀释，用流式细胞仪种细胞也按照每孔5-10个细胞进行接种。在这些孔中我们检测到有阳性细胞后，再用该孔细胞挑一次单克隆即可，第二次挑单克隆的阳性比例将直接上升到10%-20%。两种情况下，我们推荐采用上面介绍的方法：第一，敲除片段在1000kb以上；第二，敲除片段在1000kb以下，PCR验证有阳性细胞，但是单克隆挑选非常多次依然未筛选到阳性克隆。
洗运动鞋（运动鞋怎么保养？）洗运动鞋（运动鞋怎么保养？）生活中，很多网友可能都会苦恼运动鞋应该怎么洗才能更干净，尤其是下雨天穿着后，鞋子往往变得脏脏的，运动鞋应该如何清洗和保养？接下来小编就给大家介绍一下，以吃粽子的注意事项（吃粽子的注意事项）吃粽子的注意事项（吃粽子的注意事项）端午的到来，我们随处可见有粽子的身影，有各式各样的粽子供我们挑选，根据改良的肉粽子也是越来越多了，一些儿童对粽子是比较青睐的，但在食用时不宜太多汽车故障诊断设备（汽车故障诊断仪器有哪些）汽车故障诊断设备（汽车故障诊断仪器有哪些）目前我国电喷汽车保有量正在快速增加，进口车也越来越多，并且车型复杂种类繁多，加上我国电喷汽车的发展迅速，因而使汽车维修工作迫切需要功能强大卫生间防水补漏方法（卫生间防水补漏方法）卫生间防水补漏方法（卫生间防水补漏方法）家住共富一村的李阿姨家里最近发现靠近卫生间墙面的那堵墙脚表面的乳胶漆一直起皮开裂，期间也找了装修公司过来维修过，可是刚刚修好过了一段时间起皮c墙面防水处理（墙角做防水怎么处理）c墙面防水处理（墙角做防水怎么处理）很多防水工程的好坏都是从细节处着眼，比如室内阴阳角的处理。阴阳角确实是一个在防水施工中容易被忽略的角落，据统计在实际施工中厨卫间渗水80的原因都删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录）删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录）1。手机微信中的聊天记录，例如图片，文字，语音等，一般情况下是可以一直保存的，如果你将聊天记录删除的话，则没办法查看了。2。聊天记删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录）删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录）现在基本上玩手机的小伙伴都有自己的微信，我们可以通过微信发朋友圈，谈生意，聊天等等，有时候我们可能不小心把聊天记录给弄没了，而且是删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录还能）删除的微信聊天记录还能恢复吗（删除的微信聊天记录还能）微信自带的聊天记录备份功能太难用，想必已经成为很多人的共识。究其原因，首先是因为它的备份速度实在是太慢。每次世超通过局域网备份微信被拉黑还能查聊天记录吗（查已删除的微信聊天记录）微信被拉黑还能查聊天记录吗（查已删除的微信聊天记录）微信现已成为咱们最常用的谈天东西，由于微信的运用率非常高，咱们也常常会拾掇一下微信谈天记载和其他软件的缓存文件来腾出手机空间。但如何找到被删除的微信支付记录（微信删了的支付记录还可以恢复吗）如何找到被删除的微信支付记录（微信删了的支付记录还可以恢复吗）随着移动支付的盛行，微信支付早已经成为了我们日常用到的付费方式之一。由于微信支付非常方便，以至于我们经常会忍不住剁手，微信换了台手机怎么查聊天记录（有办法查到别人微信聊天记录）微信换了台手机怎么查聊天记录（有办法查到别人微信聊天记录）微信现已成为我们最常用的谈天东西，因为微信的运用率十分高，我们也常常会收拾一下微信谈天记载和其他软件的缓存文件来腾出手机空