生物制品中氨基酸成分的研究

　　徐涛 秦博 王晓丽
　　【摘 要】氨基酸分析在重组蛋白质类生物制品的质量控制中发挥着重要作用，为重组蛋白的结构确证和功能研究提供重要的一局。基于此，文章对一种多肽药进行了氨基酸成分实验研究，希望为相关行业人员提供一些借鉴。
　　【关键词】氨基酸分析；重组蛋白；生物制品；质量控制
　　生命科学的不断发展使人们发现了更多具有重要功能蛋白质分子，在此基础上发展起来的重组蛋白药物具有副作用小、用量少、药效强的特点，在疾病治疗和预防方面发挥着重要的作用。
　　一、实验材料和方法
　　本文检测了一种含有20个氨基酸的多肽药，具体检测方法如下。
　　（一）条件参数：
　　仪器：高压液相色谱仪（HPLC）
　　色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：沃特世Xbridge（多肽）BEHC185微米粒径4.6毫米的内径×250毫米的长度）；
　　洗脱速度：每分钟1.0毫升；
　　分析波长：设置在248纳米；
　　色谱柱温度：设置在37℃；
　　进样体积：10μl。
　　洗脱液A：称取11.5g无水醋酸钠固体，加入去离子水溶解，再加入乙二胺四乙酸二钠溶液1ml和（C2H5）3N溶液2.4ml，再利用H3PO4调溶液pH值至4.95，最后加去离子水至1000ml。
　　洗脱液B：乙腈（HPLC级）、超纯水（60∶40）
　　梯度淋洗方式如下：
　　（二）样品溶液配制
　　对照品溶液：精密称定门冬氨酸（Asp）的对照品83.17毫克，谷氨酸（Glu）的对照品92.17毫克，精氨酸（Arg）的对照品108.68毫克，脯氨酸（Pro）的对照品72.69毫克，酪氨酸（Tyr）的对照品112.98毫克，亮氨酸（Leu）的对照品81.95毫克，异亮氨酸（Ile）的对照品81.99毫克，苯丙氨酸（Phe）的对照品103.53毫克，甘氨酸（Gly）的对照品47.13毫克，加0.1mol/L盐酸溶解并定溶于250ml量瓶中。然后将100μl该溶液置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液和200μl衍生化试剂溶液，混匀后，放入55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，待充分反应10分钟后，取出并放置至室温，作为对照品溶液。
　　供试品溶液：精密称取10.0mg本品，将其放置在裂解瓶中，然后加入5ml浓度为6mol/L的盐酸，并充入一定质量氮气密闭保护，将裂解瓶放置于120℃温度条件下反应24小时，然后将其取出放置至室温，用NaOH中和HCl，调pH为8～10之后，再将溶液转移到容量为50ml量瓶中，并用去离子水定容。精密移取100μl置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液和200μl已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，取出放置至室温，作为供试品溶液
　　（三）氨基酸测定
　　将已经配制好的对照品溶液精密量取10l注入HPLC，按此操作连续进样3针，记录氨基酸色譜图并测量峰面积，3针峰面积的相对标准偏差应控制在≤2.0%以内。然后精密量取供试品溶液10l并注入高压液相色谱仪中，按此操作连续进样2针，记录色谱图，并计算样品中各氨基酸的摩尔数，并以酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的相对摩尔比为1，分别计算其他氨基酸的相对摩尔比，取其平均值。其中氨基酸的摩尔数计算公式：
　　（式中：Ai-----供试品溶液中氨基酸的峰面积；A-----对照品溶液中氨基酸峰面积的平均值；C-----氨基酸对照品的浓度。（单位：mmol/ml））。
　　（四）建立快速氨基酸测序
　　1.Edman降解第1轮反应
　　第一，将50ul1%的PITC-50%吡啶溶液加入到1号样品中，在旋转仪上混合均匀后充入氮气。
　　第二偶合：将1号样品管充氮10s，将管塞塞进，混合均匀后，将样品管放置在温度为50℃的恒温水浴锅中反应20min。需要注意的在反应过程要不时摇动样品管，在反应结束后取出，立即置于冰水浴中冷却。
　　第三，初洗：向偶合后的样品管加入500ml庚烷：乙酸乙酯（10∶1，V/V），然后充入一定质量的氮气密闭保护，将管塞盖紧并将管内溶液摇匀，洗涤一次。洗涤后离心机（3500rpm）离心3分钟，然后用滴管将上层的有机相移走，将剩下的水相层进行真空干燥或者用氮气将其吹干。
　　第四，复洗：用500ml庚烷：乙酸乙酯（2∶1，V/V）洗涤一次，在每次洗涤过后，采用离心机（3500rpm）离心3分钟，用滴管将上层的有机相移走，将剩下的水相层进行真空干燥或者用氮气将其吹干。
　　第五，抽提PTC-aa：将裂解后的样品置于冰浴中，向样品管中加入50ul5%的吡啶溶液（蒸馏水），混匀。使混合物完全溶解。用250ml冷水饱和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提过程均需充氮气，采用离心机（3500rpm）离心3分钟。合并3次的上层有机相，真空干燥，保存并标记为＂PTC-aa1＂。下层水相真空干燥后可以开始下一轮Edman降解。
　　2.Edman降解第2轮反应
　　第一，将②号样品加入1中，再加入100ul1%的PITC-50%吡啶溶液，充氮气，在旋转混合仪上混匀。
　　第二，偶合：在1号样品管充入10s氮气，盖紧管塞并摇匀，然后将样品管置于50℃的恒温水浴锅中保温反应20min。反应途中要不时摇动，待反应结束后将样品管去除放置在冰水浴中冷却。
　　第三，初洗：向偶合后的样品管加入500ml庚烷：乙酸乙酯（10∶1，V/V），充入一定质量的氮气，盖紧管塞并摇匀，洗涤一次。洗涤后采用离心机（3500rpm）离心3分钟，用滴管将上层的有机相移走，将剩下的水相层进行真空干燥或者用氮气将其吹干。
　　第四，复洗：用500ml庚烷：乙酸乙酯（2∶1，V/V）洗涤一次，每次洗涤后采用离心机（3500rpm）离心3分钟，利用滴管将上层的有机相移走，将剩下的水相层进行真空干燥或者用氮气将其吹干。
　　第五，抽提PTC-aa：将裂解后的样品置于冰浴中，向样品管中加入50μl5%的吡啶溶液（蒸馏水），混匀。使混合物溶解。用250ml水饱和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提均需充氮气，采用离心机（3500rpm）离心3分钟。合并3次上层有机相，真空干燥，保存并标记为＂PTC-aa2＂。下层水相层蒸干后可以开始下一轮Edman降解。
　　3.Edman降解第3、4......N轮反应即重复Edman降解第1、2轮反应
　　二、实验结果与讨论
　　本次实验利用高效液相色谱仪测定了多肽药物中的氨基酸成分，并通过相对摩尔比计算得出本样品中含有精氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸分别在0.80～1.20之间，含天冬氨酸、苯丙氨酸（D-苯丙氨酸）分别在1.60～2.40之间，含脯氨酸在2.40～3.60之间，含谷氨酸在3.40～4.60之间，含甘氨酸在4.20～5.80之间，考虑到试验的误差，实验值与理论值的偏差范围约在±20%之内。
　　三、结束语
　　总而言之，随着基因工程技术的应用，氨基酸分析技术也取得了很大的进步，人们可以利用此技术对蛋白质进行改造、设计和表达，从而得到各种各样的重组蛋白，为新型生物制品的研究提供了很大的帮助，也为重组蛋白的结构、功能等方面的研究带来了方便。
　　【参考文献】
　　[1]李宇，赵兵，蒋慧，等.驴奶和牛奶游离氨基酸成分分析研究[J].中国乳业，2017（10）：68-71.
　　[2]许旻，乔琨，路海霞，等.海洋多肽功能活性与氨基酸组成的研究进展[J].渔业研究，2017，39（6）：502-508.