基于紫外分光光度法的土壤过氧化氢酶活性的测量

　　【摘 要】土壤酶作为土壤中的重要成分，对其的研究能够较为准确的反映土壤生物活性，过氧化氢酶是其中非常重要的一种酶类，对其活性的测量有着重要意义。为了得到一种方便、可靠的测定方法，本文就基于紫外分光光度法的土壤过氧化氢酶活性的测量展开研究。结果表明，紫外分光光度法具有较好的重现性、稳定性，且操作简单，值得推广应用。
　　【关键词】紫外分光光度法；土壤；过氧化氢酶；活性
　　土壤酶活性可以有效地反映土壤生化反应强度，以及土壤肥力水平，而且土壤中的各种生化反应与养分转换大多都离不开土壤酶的参与。就其来源来说，土壤酶主要源自于各类微生物的活动以及植物的生长，对土壤的耕作、周边环境的改变都会在一定程度上影响其活性。过氧化氢酶，是其中非常重要的一种酶类，与生物的新陈代谢、生物分解密切相关，而在生物体中，其可以起到破坏过氧化氢的作用。因此，对过氧化氢酶的研究有着重要的应用价值，一直以来，众多学者都在努力探索一种简单、方便、准确的测量其活性的方法。本文就基于紫外分光光度法的土壤过氧化氢酶活性的测量进行研究，希望为相关领域的研究提供一定参考。
　　一、材料与方法
　　（一）材料
　　试验材料包括以下几种：红壤1、红壤2、山地黄壤和山地暗黄棕壤。材料取回后需挑出植物根系、碎石等杂物，等待自然风干后过1mm筛备用。
　　（二）方法
　　1.紫外分光光度法
　　过氧化氢酶的作用，可使过氧化氢分解为水和氧气。在样品中加入定量的过氧化氢，经过一段时间后，计算加入与剩余量之差即为与酶发生反应分解的过氧化氢，用以表示酶活性。过氧化氢（H2O2）在240nm处有强烈吸收，通过测定样品在此状态下的吸光度，就可得到过氧化氢的浓度。
　　称取样品2.00 g，添加40 ml蒸馏水，加入5 ml H2O2溶液，经过震荡20分钟。迅速添加铝钾矾1 ml，过滤于5 ml 1.5 mol L-1的硫酸溶液中。经滤干处理，将滤液在240 nm处测定吸光度As。同时做无土A0和无基质Ak对照。
　　2.高锰酸钾滴定法
　　称取样品2.00 g，添加40ml蒸馏水，加入5 ml 的H2O2溶液，经过振荡20分钟后加入1ml铝钾矾，过滤于盛有5 ml 1.5 M硫酸中，经滤干处理，吸取滤液25 ml，用高锰酸钾溶液滴定至紫色，同时做无土对照。
　　二、结果分析
　　（一）方法的重现性
　　称取20份红壤1样品，各2.00g，10份用于加基质的反应，另外10份用于无基质对照，同时做一份无土对照。根据测定方法处理溶液的吸光度后，取样25ml用高锰酸钾溶液处理，分别比较两种方法下的酶活性。
　　研究表明，两种方法测得的平均值极为接近，用t检验，两种方法得到的结果之间无明显差别（P=0.663）。在重现性上来看，高锰酸钾法的标准差、变异系数均高于紫外分光光度法。这表明后者的重现性要好于前者。
　　（二）稳定性
　　称取10份红壤1样品，各2.00g，5份加入过氧化氢，另外5份不加用于对照。严格按照顺序测算吸光度，之后分别放置2、3、4、11小时后进行测定。结果表明，时间对吸光度的影响不大，无论是哪一组，都无明显差别，这就表明在酸性环境下，过氧化氢非常稳定，吸光度无明显改变。
　　（三）硫酸加入方法的影响
　　称取20份红壤2样品，各2.00g，分别采取以下四种处理方法：第一种，加H2O2振荡后加酸迅速过滤；第二种，加H2O2振荡后直接过滤到盛有酸液的容器中；第三种，无基质对照加酸后过滤；第四种，无基质对照直接过滤到盛有酸液的容器中；每种重复5次。结果表明，不同的加入顺序对吸光度有很大影响。第一种方法，吸光度已超过了仪表的读数范围，难以测得数值；第三种方法，吸光度也超过了1，这已是无法测得酶的活性，该种方法下的溶液有颜色，就算是用容量法也对终点判定有很大影响，在有机质含量较高的条件下已无法滴定；第二种与第四种方法，其吸光度均在相应范围内，由此得到的酶活性之间无明显差别。
　　（四）铝钾矾的影响
　　称取30份红壤2样品，各2.00g，分别采取以下六种处理方法：加H2O2与不加H2O2的无基质对照。按振荡前加、振荡后加1ml铝钾矾和不加铝钾矾，各重复5次。结果表明，是否加入铝钾矾、采用何种方式加入都会对吸光度产生影响。不加铝钾矾时，过滤速度非常慢，溶液比较浑浊，因此不加铝钾矾的吸光度要高。加入顺序对有基质样品的吸光度有很大影响，振荡前大于振荡后的吸光度。加入顺序对无基质对照的吸光度无影响，各组吸光度无明显差别。
　　（五）不同土壤上的运用
　　取不同的土壤样品分别进行过氧化氢酶活性的测量，各重复5次。结果表明，不同土壤的过氧化氢酶活性的测量结果之间无明显差别，这证明了紫外分光光度法可应用于过氧化氢酶活性的测量。
　　三、讨论
　　对于土壤过氧化氢酶的测量有多种方法：（1）高锰酸钾法。该种方法比较简单，但测量过程人为产生误差大，且所需时间长。（2）气量法。该种方法需准备特定装置，过程繁琐，不易批量分析，且定量误差比较大。（3）气相色谱法。该种方法同样需准备特定仪器，且价格昂贵，过程复杂，不便普及。（4）可见分光光度法，该种方法的原理是通过过氧化氢酶的作用，可使过氧化氢发生分解，而形成的一种有色物质在505nm处有强吸收，但该法的实验过程也比较复杂，同时还需提供过氧化物酶，成本比较高。因此，近年来人们希望得到一种简单、易用、可批量分析的土壤过氧化氢酶测量方法，这对于相关领域的研究有着重要意义。本文的研究表明，紫外分光光度法具有很好的重现性、稳定性，且操作简便、可用于批量分析、成本也不高等，值得推广应用。
　　通过试验发现，应用紫外分光光度法的过程中，需要在振荡后将溶液过滤到硫酸中，而不是先加酸再过滤。因为如果按照后一种操作方法，会使土壤中的某些有机物质发生溶解，使得溶液出现颜色，进而影响试验进程。事实上，对于有机含量较高的样品，就算用容量法，也会在很大程度上受到溶液颜色的影响。
　　加酸主要是用于停止酶与H2O2的反应，而且在容量法中，用高锰酸钾滴定时，需要在酸性环境下进行。本试验结果表明，用紫外分光光度法进行测量时，不可以在过滤前加酸，因此要将溶液过滤到盛有酸容器中，从而有可能延长酶与基质的反应时间，得到的结果偏高。为了缩减过滤时间，需加入饱和铝钾矾。结果表明，加入铝钾矾后，不但加快了过滤速度，而且也使其变得更加透明，不加铝钾矾则过滤速度较慢，溶液浑浊，从而出现较大的吸光度。将振荡前与振荡后加铝钾矾的吸光度比较，前者明显超过后者，表明铝钾矾对过氧化氢酶起到了抑制作用，因此在振荡后过滤前加饱和铝钾矾，不但能够加快过滤速度，使溶液变得透明，而且還能够有效抑制酶与基质的反应，减少误差。总的来说，紫外分光光度法操作方便，重现性、稳定性都比较理想，而且并不需要任何特殊制剂的参与，成本可控。
　　四、结论
　　本文的试验结果表明，紫外分光光度法在重现性、稳定性上都比较突出，得到的测量结果与高锰酸钾法无明显差别，可以说想要测量土壤过氧化氢酶活性，紫外分光光度法是一种值得推广的方法。
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