转基因技术的应用（转基因技术的应用实例）

　　转基因技术的应用（转基因技术的应用实例）
　　作者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所张仁森 狄冉 胡文萍 储明星
　　来源：基因农业网
　　进入21世纪，随着人口的增加以及人们需求的改变，农产品的供需矛盾也越发的明显，传统的农业生产技术已经很难满足人们各式各样的需求。转基因技术可以大大提高农业的生产效率，因此得到越来越多的关注。到目前为止，转基因技术已经广泛应用于农业、医学、工业、环境保护等多个领域，国际上转基因植物研发已从抗虫、抗除草剂等第一代产品向改善营养品质、提高产量、耐储藏等第二代产品以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合正成为转基因技术研究与应用的重点内容。作为农业科研工作者，在这里我们想谈谈转基因技术以及转基因技术在农业领域中的应用。
　　什么是基因？
　　生物体由各种各样的细胞组成，细胞从外至内的结构为细胞膜、细胞质、细胞核，细胞核中存在一种叫做染色体的物质，不同生物有不同数量的染色体，比如人有23对染色体，也就是46条染色体，每条染色体是由一条DNA双螺旋和许许多多的组蛋白相互缠绕所构成，那么这个DNA双螺旋中某个小的片段所编码的序列便是我们所说的基因（对于原核生物，比如某些病毒，是以RNA序列作为遗传信息的载体）。基因是遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列。
　　基因并不神秘，DNA也并不神秘。实际上DNA分子就是由两条核苷酸链以互补配对原则所构成的双螺旋结构的分子化合物，它分为编码链和模板链，编码链上含有与生命活动息息相关的遗传信息即基因。DNA双螺旋就像火车的铁轨一样，不过为了节省空间，生物体把这条＂铁轨＂尽可能地进行了扭转和折叠，所以在电子显微镜下它们看起来像是一团不太规则的毛线团。一个染色体只包含一条DNA双螺旋，在这条＂铁轨＂上包含了许许多多的基因。不同物种中基因数量差异很大，如简单的RNA病毒只有8个基因，流感病毒大约有1700多个基因，大肠杆菌有近4300个基因，水稻大约有46000至55000个基因，人类大约有25000多个基因。不同的物种之间有一些相似的基因，但是同时也存在一些物种特异性的基因，所以可以将某些物种特异的优良基因转移到目标物种中，这就是我们常说的转基因。
　　什么是转基因技术？
　　转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，通过外源基因的稳定遗传和表达，从而使生物体具备自己本身并不具备的性状，从而使其更好地满足人们的需求。这里所说的基因不是凭空捏造的基因，而是在自然界中某些物种中特异存在的基因。如美国2015年批准上市的转基因鲑鱼。野生的鲑鱼肉质鲜美，但生长速度过于缓慢，往往需要4~5年才能上市；而另外一种大马哈鱼其生长速度虽然快，但是肉质并不受人们的欢迎，所以科学家找到这种鱼里面决定快速生长的基因，并将其转入野生的鲑鱼中，从而培育了生长速度既快肉质又鲜美的转基因鲑鱼，从而更好地满足了人们的需求。又如普通棉花对棉铃虫的抵抗能力很差，而转入苏云金芽孢杆菌Bt基因的棉花对棉铃虫的抵抗能力显著增强。
　　转基因技术分类
　　人们总是会有一个疑问，会不会我们吃了转基因的食物，这个基因也会转到我们的体内呢？其实，一个基因从一个物种的基因组转移到另外一个物种的基因组中去，需要特别的技术，也就是我们所说的转基因技术。绝对不可能简单通过食入等方式就能实现转基因！根据生物种类不同，转基因技术主要分为三类：植物转基因技术、动物转基因技术和微生物转基因技术，下面我们来一一进行介绍。
　　目前，植物转基因技术主要包括农杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法、电激穿孔法和花粉管通道法。
　　农杆菌介导法：农杆菌介导法是先将插入目的基因的植物表达载体转入农杆菌中，然后通过农杆菌侵染植物，即将根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒上的目的基因导入植物受体细胞并整合到其基因组中，从而完成目的基因的转化。农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能在自然条件下感染大多数的双子叶植物的受伤部位，并可诱导植物产生冠瘿瘤或发状根。我们日常在地里看见的许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处的一种帽状肿瘤，就是由农杆菌感染造成的。现代分子生物学研究发现，农杆菌的细胞中含有一种特殊的质粒，分别为Ti质粒或Ri质粒。当农杆菌侵染植物的伤口时，这种质粒可以把其中的一段包含多个基因的DNA转入植物细胞并插入到植物基因组中（我们把这一段DNA称为T-DNA），这些转入到植物基因组的基因的表达导致了植物的冠瘿瘤或发状根的产生。但是，科学家只想把需要的基因转入植物细胞，并不想让植物产生冠瘿瘤或发状根，于是科学家对T-DNA做了修改，去除了其中能致瘤的基因，把需要的外源基因插入到T-DNA中，这样转入到植物细胞基因组中的T-DNA便包含了我们需要的目的基因，也不会使植物产生冠瘿瘤或发状根，从而实现对植物细胞的转基因。农杆菌介导法是目前为止应用最早、研究最深入、应用最广泛，技术相对成熟、有效的转基因方法。自1983年首次运用农杆菌介导法获得转基因植物以来，科学家相继利用该方法成功获得了番茄、牵牛花和油菜花等转基因植株。
　　基因枪法：基因枪法是美国康奈尔大学生物化学系Sanford首先提出来的，该法也被称为粒子枪法、高速微弹法等。其原理是用钨粉或金粉等金属微粒包裹外源DNA，利用高压放电或高压气体作为驱动力使金属微粒高速运动击入受体细胞或组织中，从而将外源目的基因整合到植物基因组中并培育出转基因植株。与农杆菌介导的转化法相比，基因枪法不受植物是否单子叶或双子叶类型的限制，且其载体质粒的构建也相对简单，但基因枪法产生的转基因植物中外源基因的表达不稳定，且成本较高，需要特殊的设备。
　　聚乙二醇介导法：聚乙二醇（PEG）法是由Dayey等在1980年首次建立的。它的原理是在高pH条件下的PEG与原生质体（脱去全部细胞壁的细胞）融合，原生质体膜的通透性发生改变，增强了原生质对外源DNA的吸收，使目的基因整合到原生质体的基因组上并使之发生特异表达。该法对细胞的副作用小，转化的稳定性、重复性好，并能实现一次转化多个原生质体，但是该法的转化率较低。因为PEG对原生质体有一定的毒害作用，所以该方法不能用于原生质培养，也不能用于再生困难的植物。
　　电激穿孔法：Michael等人于1985年首次使用电激穿孔法进行转基因，在1400V的高压条件下处理细胞质膜，使外源基因导入，在培养2～4天后的原生质体中检测到外源基因的瞬时表达。电激穿孔法的原理是当植物细胞受到外界高压电击时，细胞膜会出现非对称穿孔，但这种开放小孔的出现是具有可逆性的，解除电击后这些小孔会关闭，所以在此期间要利用这种小孔作为外源基因导入细胞的通道，从而使目的基因导入并整合到受体细胞的基因组上。到目前为止，电激穿孔法相继成功地应用于烟草、番茄、玉米、大豆、小麦和马铃薯等植物原生质体的转化。该法操作相对简单，但是转化效率较低。
　　花粉管通道法：1983年科学家周光宇通过研究我国远缘杂交提出了DNA片段杂交的假设，为花粉管通道法提供了理论基础，并首次通过花粉管通道法将海岛棉基因转入陆地棉，并培育出抗枯萎病棉花新品种。该法的主要原理是在植物开花之际，向植物花器的子房中注入含外源目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步整合到植物细胞的基因组中，然后随着受精卵的发育而产生转基因的新个体。该法最大的优点是不依赖植物组织培养，无需特殊仪器设备，技术简单，但是该法的重复性还有待于进一步提高。
　　目前微生物转基因方法主要包括氯化钙（CaCl2）法和电转法。
　　氯化钙（CaCl2）法：该法最先由Cohen于1972年建立。其原理是细菌处于0℃ CaCl2的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶（DNase）的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在适当的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其他的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100-1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好、菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于细菌外源基因的转化。
　　电转法：电转化的研究始于20世纪70年代。1979年首次实现了细胞电融合，1980年成功地应用于质粒导入。电转化的基本原理是，当细胞放在电场中，细胞膜起着电容器的作用，电流不能通过离子通道，随着电压升高，细胞膜组分被极化，并在细胞膜两边产生电位差。当电位差超过某一临界水平，细胞膜局部被击穿，形成一些瞬时的孔洞，孔径大小足以让大分子和小分子如（ATP）进入或从细胞中排出。如果电场强度和脉冲持续时间不超过临界限度，这种通透性是可逆的，否则细胞会遭到不可逆的损伤或死亡。
　　目前比较常用的动物转基因技术包括核显微注射法、精子介导的基因转移法、核移植转基因法和逆转录病毒法。
　　核显微注射法：在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1～2微米）直接将外源DNA注射到受精卵的细胞内，注射的外源基因与受精卵基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体动物子宫内发育。这样随着受体动物的分娩就可能产生转基因动物个体。核显微注射法是动物转基因中最常用的方法，但其存在效率低、表达不稳定、需要大量的动物供体和受体动物等缺点。
　　精子介导的基因转移法：该方法是把动物精子作适当处理后，使其携带外源基因（DNA分子结合到精子上不是随机的，精子具有自发捕获外源DNA的能力。DNA与精子结合后发生内化和整合，部分结合到精子上的DNA被内化进入精子内，并能与精子核骨架稳定结合，从而实现精子介导的基因转移）。然后用携带外源基因的精子给发情母畜授精，在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是转基因个体。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移法具有成本低且无需对受体动物进行特殊处理的优点。
　　核移植转基因法：先将基因导入到体外培养的体细胞中，筛选获得带外源基因的体细胞。然后将其细胞核取出，移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。将重构胚胎再移植到母体中，从而产生转基因动物。体细胞核移植是一种相对比较新的动物转基因技术。
　　逆转录病毒法：利用逆转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度颗粒，去直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，随后将携带外源基因的逆转录病毒DNA整合到宿主染色体上。该方法的优点是操作简单、外源基因的整合效率较高，动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入的外源基因的表达。但是反转录病毒载体容量有限，并且外源基因难以植入生殖系统，成功率较低。
　　由以上转基因方法我们可以知道，基因从一个物种转移到另外一个物种需要经过特殊的加工和处理过程才能实现基因的转移。把基因转入微生物是比较容易实现的，但是把基因转入植物和动物比较难以实现，在把基因转入植物和动物的过程中，即使这些基因经过了特殊的加工和处理，我们也要从成千上万的实验样本中才能挑选出整合了目标基因的转基因个体。所以只是通过简单的吃转基因食品是不可能被转基因的！之所以有这么多的谣传，都是因为大家对于转基因不了解导致的。
　　转基因产品
　　转基因产品是采用转基因技术改造后的生物体及加工产品，主要包括转基因生物和转基因食品。转基因生物是指经转基因技术修饰的生物体，常被称为＂遗传修饰过的生物体＂（Genetically modified organism, 简称GMO），包括转基因植物、动物和微生物，如转基因棉花、大豆，转基因鲑鱼、转基因奶牛等；转基因食品是指利用转基因技术改良的动物、植物和微生物所制造或生产的食品、食品原料及食品添加物等，如现在市场上售卖的转基因植物油等。
　　因为转基因技术可以高效精准地把某个基因从一个物种转移到另一个物种，打破了物种之间的生殖隔离（理论上来说各个物种间的基因都可以通过转基因技术实现相互交换，植物的基因可以转给动物，动物的基因也可以转给植物，而这在过去是不可能的），所以从20世纪80年代科学家成功运用转基因大肠杆菌生产胰岛素以来，转基因技术在农业、工业、医疗等领域得到了十分广泛的应用。随着人口的增加以及生活质量的提高，社会对农业提出了越来越高的要求，我们需要更多和更高品质的食物。农药的使用会对人体和环境造成极大的伤害，各种疫病每年都会造成上亿的损失，随着生活质量的提高，现在人们不仅仅满足于吃饱，更加注重营养的均衡、食物的口感等，所以现在转基因技术也被用于培育具有优良性状的品种，如抗除草剂的转基因大豆、抗虫转基因玉米、富含β-胡萝卜素的转基因大米、抗结核病的转基因牛等，充分发挥转基因农产品产量大、质量优的优点。到2018年为止，全世界转基因作物种植面积已超1.9亿公顷，种植的作物主要为大豆、玉米、棉花、油菜等，而我国批准商业化种植的只有转基因抗虫棉花和转基因抗病毒番木瓜，转基因鲑鱼是目前为止世界范围内唯一批准上市的转基因动物食品。下面对各类转基因产品进行一一介绍。
　　抗虫转基因植物：各种害虫如棉铃虫、蚜虫等每年给农业造成了巨额损失，而传统的杀虫方法是使用化学杀虫剂，化学杀虫剂过多的使用不仅会导致高额的种植成本，而且会影响人体的健康，人们需要一种新的抗虫方法。转基因技术的出现使得这种新的抗虫途径得以实现。抗虫转基因植物是指转入了抗虫基因的植物，因为转入了抗虫基因，植物本身便能对害虫产生免疫，从而减少了化学杀虫剂的使用。目前常用的抗虫基因主要有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等，抗虫Bt基因是产业应用的重点。Bt毒素是由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）自然产生的一个种类繁多的蛋白质毒素家族，其本身没有毒性，因鳞翅目昆虫幼虫肠道中存在Bt蛋白受体，当Bt蛋白与其结合时会使幼虫因肠道穿孔而死亡，但人的肠道缺乏Bt蛋白受体，所以对人却是完全无毒的。
　　抗病转基因植物：抗病转基因植物是近年来转基因植物研发的重点。和害虫一样，各种植物病毒、细菌、真菌每年不仅给农业造成巨额损失，而且农药的过量使用不仅提高了种植成本，也会对人体和环境产生伤害。通过转入抗病基因不仅节省成本，也减轻了对人体和环境的伤害。目前常用的抗病基因有植物病毒的外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、核糖体失活蛋白基因、干扰素基因、非植物起源的杀菌肽基因如拟南芥RPS2基因和番茄PTO基因等。除了商业化生产的抗病毒番木瓜，到目前为止已相继培育出了抗纹枯病、稻瘟病水稻，葡萄孢菌抗性烟草，抗炭疽病、白粉病和角斑病草莓，抗麻风病、柑橘溃疡病和青果病柑橘等。
　　抗除草剂转基因植物：杂草是在种植农作物时不得不面对的一个大问题，杂草作为作物的竞争者会竞争作物的生存空间和养分，极大降低了作物的产量。而现行的除草方法是使用化学方法除草，所谓伤敌一千，自损八百，化学除草剂的使用虽然除去了杂草，但同时也会对环境和土壤造成危害。于是科学家便尝试把抗除草剂的基因转入植物内，培育抗除草剂的植物。到2017年为止，已经有200多例抗除草剂作物进入产业化，占转基因作物种类总数的70%左右，包括抗草甘磷的大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜、水稻；抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜、水稻；抗磺酰腺类的大豆、棉花；抗溴苯腈的棉花、烟草等。中国已获得的抗除草剂转基因作物有抗Basta（一种除草剂）水稻、小麦、烟草、油菜、芝麻；抗阿特拉津大豆；抗溴苯腈油菜、小麦及抗草甘磷小麦等。BAR基因产物因能对草甘磷进行修饰，是迄今为止用得最多的一个抗除草剂基因，已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的遗传转化。另外，作为选择标记基因，抗草甘磷的AROA基因、抗溴苯腈的BXN基因和抗绿磺隆的CSRL基因等也成功用于不同作物的遗传转化。
　　抗非生物逆境转基因植物：随着人口的增加，一定面积的土地需要养活的人口也在不断增加，世界范围内适合耕种的土地是有限的，大部分土地并不适合耕种，比如高寒地带、高盐碱地带等，如果能够在这些地方进行作物种植，那么将会极大缓解目前的粮食短缺问题。事实上目前的抗非生物逆境转基因植物研发工作主要集中在抗旱、耐盐碱、抗高温、耐低温转基因植物上。山东师范大学生物学院实验室已培育出耐盐转基因番茄、大豆、水稻、速生杨；孟山都公司已经在美国西部推广种植全球第一例耐旱转基因玉米；科学家还成功地将北冰洋比目鱼的抗冻基因导入草莓中，获得的转基因抗冻草莓已在美国上市销售。其它已经培育的抗冻植物包括抗冻西红柿、抗冻烟草等；目前的研究还发现通过转入耐盐碱的基因，玉米的耐盐碱性也得到了一定的提高。
　　品质改良转基因植物：转基因技术还可以用来提高植物的营养价值（提高蛋白品质、提高能量品质、提高维生素含量、提高微量元素含量），改善食物的口感等。其中最为著名的可能就是黄金大米了，对于发展中国家而言，维生素A的缺乏是导致儿童失明的首要原因，于是科学家将与β-胡萝卜素合成相关基因转入水稻中，从而培育了颜色金黄的黄金大米，该大米可以极大改善儿童维生素A缺乏的症状。科学家还利用转基因技术在植物中表达编码半乳糖内脂脱氢酶的基因，从而提升了植物的维生素C的含量；将玉米种子中富含必需氨基酸的基因导入马铃薯中，使得转基因马铃薯茎块中的必需氨基酸含量提高了10%以上。到目前为止还培育出了增加花青素的转基因柑橘，增加叶酸的谷物（如水稻、小麦、高粱等）和非谷物（如马铃薯、香蕉等）；科学家还培育了富含ω-3脂肪酸健康因子的转基因芥蓝籽；2017年，美国批准了转基因菠萝的商业化，该菠萝使番茄红素大量积累并呈现粉色，比黄心菠萝具有更高的抗癌、保护心血管及防治多种疾病的功效。
　　复合性状转基因植物：如果一种植物不仅营养丰富、口感好，还可以抵御各种病虫害和各种非生物逆境，那么它将会极大降低生产成本，丰富人们的物质生活。事实上利用多基因聚合获得复合性状转基因植物是目前转基因植物研究领域内的重点和热点。美国孟山都公司已经与陶氏公司合作研发出了八重抗逆抗虫特性的组合品种SmartStax，该品种可以一并防治地上地下昆虫并且抗广谱除草剂。加拿大批准了还原糖水平降低、丙烯酰胺减少、具有损伤抗性的复合型转基因土豆的商业化。
　　其它转基因植物：其它的转基因植物包括控制果实成熟的转基因植物、提高产量的转基因植物、耐储藏及养分高效利用的转基因植物等。比如通过转入控制乙烯合成的关键酶基因，可延长某些水果和蔬菜瓜果的保鲜期；利用转基因技术可以提高黑麦草的代谢能力，使产量增加约40%；利用转基因技术获得的耐损伤及防褐化的转基因马铃薯可以变得更加耐储藏；可以通过转入编码铁调节蛋白促进植物的微量元素摄取等。
　　目前为止世界范围内批准上市的转基因动物产品只有转基因鲑鱼，但是转基因技术在动物的抗病育种和品质改良方面也取得了重要进展。
　　抗病转基因动物：各种疫病如口蹄疫、禽流感、牛结核病等的爆发每年给畜牧业造成了成千上万亿的损失，尤其是人畜共患的疫病如疯牛病和布氏杆菌病不仅给农业造成重大损失，还威胁着人们的生命和健康。随着转基因技术的出现，运用该方法去培育具有强抗病能力的新品种将会是控制这些疾病传播的全新的高效的手段。到目前为止已培育的抗病品种包括抗禽流感的转基因鸡、抗蓝耳病的转基因猪、抗布氏杆菌病的转基因羊、抗结核病的转基因牛等。
　　品质改良转基因动物：近些年来，利用转基因技术培育产肉量、肉品质、产毛率及毛品质提升的家畜新品种一直是动物转基因领域的研究重点。2015年，美国批准上市了目前唯一的转基因动物食品—转基因鲑鱼，该鱼的生长速度比普通的鲑鱼要快一倍左右。科学家将肠乳糖酶基因转入奶牛中，培育了能生产低乳糖或无乳糖乳汁的转基因奶牛（多数人不能完全消化乳糖或对乳糖存在过敏现象）；此外，科学家通过过表达FSH基因提高了公猪的生精能力。
　　转基因技术在其它领域的应用：除了农业领域，转基因技术在其它领域也得到了广泛应用。在工业领域主要用转基因技术来制作食品添加剂、培养各类益生菌等。在医疗方面，目前最为火热的研究集中在＂molecular farming＂、动物乳腺反应器等，科学家把相应的目的基因转入动植物，利用动植物本身的功能来制备相应的蛋白、疫苗、药物等，以解决部分蛋白、药物在制作、提取等方面存在的伦理学、社会学难题；此外，转基因动物模型的构建也是当前研究的重点；科学家还利用转基因微生物来降解塑料、用转基因技术来培育生物质能源植物新品种等。
　　转基因技术在农业应用上的展望
　　人口增加所造成的粮食短缺、资源匮乏、环境恶化等全球性问题正对传统农业提出了严峻挑战，我们需要更加高产、抗逆性更强的植物和动物品种。传统的杂交育种方式培育一个品种往往需要几代甚至几十年的时间才能完成。相比于传统的育种方式，转基因技术可以精准地把一个基因转入到目标生物体内，可以极大缩短培育新品种的时间，且转基因技术可以打破物种间的生殖隔离，实现不同物种间的基因交流。在过去几十年中，转基因植物的种植面积越来越大，虽然到目前为止上市的转基因动物只有转基因鲑鱼，但是已有很多种转基因动物已经进入评估阶段，而且表现出了优异的表型特征，具有良好的产业化前景。公众对于转基因知识不了解，使得转基因受到了很多质疑，但是在过去几十年中转基因技术对农业的巨大贡献是毋庸置疑的。我们有理由相信，科学家会用好转基因技术，让转基因技术更好地造福人类。
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