石蜡包埋（石蜡切片免疫组化）

　　石蜡包埋（石蜡切片免疫组化）
　　1、组织的采集、固定和保存：
　　采取组织后，
　　方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
　　方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）
　　PBS缓冲液洗三次，每次5min，4°C保存于70%乙醇中。
　　2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
　　固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54°C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10mm，贴于处理过的干净载玻片上，37°C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
　　石蜡包埋：
　　保存于4°C 70%乙醇中的组织样品
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　　80%乙醇 15 min
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　　95%乙醇 15 min
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　　100%乙醇 15min ´ 2
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　　1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
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　　二甲苯透明 5-10 min
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　　1/2二甲苯1/2石蜡 30 min
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　　石蜡（1） 1.5hr
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　　石蜡（2） 1.5-2.5hr
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　　石蜡（3） 包埋
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　　RT保存
　　3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
　　密封保存于RT的组织切片
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　　二甲苯(1) 20 min
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　　二甲苯(2) 20 min
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　　100%乙醇 20min
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　　95%乙醇 10 min
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　　80%乙醇 10 min
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　　通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
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　　切片在PBS中浸泡 5 min*2
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　　0.4%Tritonx RT 10 min
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　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　3%H2O2 RT10min
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　0.25%胰酶RT10min
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
　　倾去blocking buffer，勿洗
　　一抗4°C overnight in blocking buffer
　　取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
　　如果是增强型DAB只要1min即可。
　　切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，
　　玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
　　若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）
　　脱水85%乙醇 5 min
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　　95%乙醇 5 min
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　　无水乙醇 5 min
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　　无水乙醇 5min
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　　二甲苯(1) 10min
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　　二甲苯(2) 10min
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　　中性树胶封片，室温干燥保存
　　4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
　　密封保存于RT的组织切片
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　　二甲苯(1) 20 min
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　　二甲苯(2) 20 min
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　　100%乙醇 20min
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　　95%乙醇 10 min
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　　80%乙醇 10 min
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　　通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
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　　切片在PBS中浸泡 5 min*2
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　　0.4%Tritonx RT 10 min
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　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　0.25%胰酶RT10min
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
　　倾去blocking buffer，勿洗
　　一抗4°C overnight in blocking buffer
　　取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
　　荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h
　　DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）
　　切片在PBS中浸泡 5 min*3